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蛋白定量檢測試劑核心作用與重要性

更新時間:2025-11-22      點擊次數(shù):155
  蛋白定量檢測試劑的作用是快速、準確地測定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。
  一、核心作用與重要性
  1、標準化實驗:在許多生物學實驗中,如WesternBlot、ELISA、細胞轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)純化等,需要確保每個反應(yīng)中加入等量的蛋白質(zhì)。蛋白定量是保證實驗結(jié)果可比性、可重復性和準確性的第一步。
  2、評估樣品質(zhì)量:在蛋白質(zhì)純化過程中,通過測定不同步驟中蛋白質(zhì)的濃度,可以計算回收率、純化倍數(shù),從而評估純化方法的效率。
  3、診斷與醫(yī)療應(yīng)用:在臨床檢驗中,測定血液、尿液等體液中的特定蛋白質(zhì)(如白蛋白、免疫球蛋白)濃度,是診斷多種疾?。ㄈ绺文I功能異常、營養(yǎng)狀況、免疫疾病)的重要指標。
  二、工作原理
  蛋白定量試劑的核心原理是利用蛋白質(zhì)的特定化學性質(zhì)或氨基酸殘基與染料發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生可檢測的信號(通常是顏色變化或熒光變化),這個信號的強度與蛋白質(zhì)的濃度成正比。
  主要的原理包括:
  - 還原銅離子反應(yīng):蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下將Cu??還原為Cu?,后者與試劑中的其他物質(zhì)反應(yīng)生成有色絡(luò)合物。
  - 與特定氨基酸反應(yīng):與蛋白質(zhì)中的精氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸或堿性氨基酸發(fā)生反應(yīng)。
  - 染料結(jié)合:某些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后,其吸光度或熒光性質(zhì)會發(fā)生改變。
  - 紫外吸收:蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸在280nm處有特定的紫外吸收峰。
  三、常見的蛋白定量檢測方法及對應(yīng)試劑
方法名稱 常用試劑 原理 優(yōu)點 缺點 適用場景
BCA BCA試劑盒 蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下將Cu²?還原為Cu?Cu?BCA試劑反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物(562nm)。 靈敏度高 不同蛋白質(zhì)因氨基酸組成不同,顯色有差異 常用、通用的方法之一,尤其適用于含有去垢劑的細胞裂解液樣品。
抗干擾能力強(對去垢劑耐受性好) 反應(yīng)時間較長
操作簡便  
Bradford 考馬斯亮藍G-250染料 染料與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸和芳香族氨基酸結(jié)合,顏色由棕紅色變?yōu)樗{色(595nm)。 非??焖伲?/span>~5分鐘) 對去垢劑非常敏感(如SDS、Triton 適用于成分簡單、不含干擾去垢劑的純化蛋白樣品。
靈敏度高 不同蛋白質(zhì)差異大
成本較低 染料易附著在器皿上
Lowry Folin-酚試劑 第一步與BCA類似(銅離子反應(yīng)),第二步與Folin-酚試劑反應(yīng),增強信號。 靈敏度高于BCA 步驟繁瑣 經(jīng)典方法,現(xiàn)多被BCA法取代。
干擾物質(zhì)多
現(xiàn)已較少使用
紫外吸收法 無特殊試劑,直接測量 利用蛋白質(zhì)中TrpTyr280nm的紫外吸收。 無損樣品,可回收 受核酸污染干擾嚴重(核酸在260nm有強吸收)  
極其快速簡便 需要蛋白質(zhì)含有芳香族氨基酸  
無需制作標準曲線    
  四、標準操作流程
  無論使用哪種試劑,基本流程都遵循以下步驟:
  -制備標準品:用已知濃度的標準蛋白(通常是牛血清白蛋白BSA)配制一系列梯度濃度的溶液。
  -與試劑反應(yīng):將標準品和待測樣品分別與定量試劑混合,在特定溫度下孵育一定時間。
  -檢測吸光度:使用酶標儀或分光光度計測量各管在特定波長下的吸光度值。
  -繪制標準曲線:以標準蛋白濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。
  -計算未知濃度:將待測樣品的吸光度值代入標準曲線的回歸方程,計算出其蛋白質(zhì)濃度。
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